人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（國(guó)家干細(xì)胞資源庫(kù)）

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基

貼壁 呈梭形

細(xì)胞培養(yǎng)的原理和步驟，簡(jiǎn)單好用以及精確！

今天我們要講解的是，細(xì)胞培養(yǎng)的原理和步驟，簡(jiǎn)單好用以及精確，學(xué)完之后，相信你對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將不再陌生。接下來(lái)就開(kāi)始今天的學(xué)習(xí)吧！

細(xì)胞培養(yǎng):體外模擬體內(nèi)需要的生長(zhǎng)條件（溫度，營(yíng)養(yǎng)等），然后加上一些處理?xiàng)l件，比如做藥物篩選，就可以做抗性基因的表達(dá)的篩選，比如還可以測(cè)定某個(gè)基因敲低或是過(guò)表達(dá)的產(chǎn)物，這個(gè)當(dāng)然要結(jié)合WB來(lái)看最后基因的表達(dá)產(chǎn)物是否升高哦，細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用還有很多。

細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理：細(xì)胞傳代（生存空間和營(yíng)養(yǎng)不足，長(zhǎng)得太密，代謝廢物太多，要洗洗，同時(shí)也要分離出一部分細(xì)胞，要加入新的培養(yǎng)液），換液（生存空間和營(yíng)養(yǎng)剩余，但是代謝廢物太多，要洗洗，要吃飯，才能長(zhǎng)好，所以要洗和加入新鮮培養(yǎng)基），凍存（太多了，先存起來(lái)，液氮里面里就是低溫，保存能量，活得久），復(fù)蘇（解凍，恢復(fù)吃飯的能力，恢復(fù)生長(zhǎng)。）這四步。

細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟（一定要明白每個(gè)步驟的意義和目的）：

01細(xì)胞傳代（貼壁細(xì)胞）：

試劑：PBS,胰mei，含血清的培養(yǎng)基；

流程：顯微鏡下看一看培養(yǎng)皿里的細(xì)胞多不多，太多（80%~90%）會(huì)導(dǎo)致代謝廢物很多，先吸掉廢液，再用PBS洗一洗，同時(shí)太多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞黏在一起，這時(shí)候就需要加點(diǎn)胰mei消除它們之間的粘性，是否消除完，在顯微鏡下看一看，看完加入適宜的含血清的培養(yǎng)基，中和一下胰mei，這叫吹打，除此之外，細(xì)胞太多了，把一部分細(xì)胞移出來(lái)，加入適量的培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，這叫傳代。

02細(xì)胞換液：

試劑：PBS，含血清的培養(yǎng)基；

流程：先吸掉代謝廢物（即細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液），再用PBS洗一洗，由于細(xì)胞長(zhǎng)得不是很多，細(xì)胞之間沒(méi)有黏在一起，因此不需要加入胰mei來(lái)消除它們之間的粘性。由于細(xì)胞要吃飯，加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基，最后放到孵箱里面進(jìn)行培養(yǎng)。

03細(xì)胞凍存：

試劑：凍存液，PBS，胰mei，含血清的培養(yǎng)基；

流程：要凍存，先配置凍存液，凍存液包含了：DMSO：防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液會(huì)形成冰晶，滲透壓會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)紊亂，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)損傷。凍存液制備時(shí)，一般需與血清一起配置：因?yàn)閮烧呋ト跁r(shí)，會(huì)散發(fā)熱量，所以凍存液需提前制備。

因?yàn)榧?xì)胞太多了，需要凍存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成細(xì)胞懸液，離心，吸掉上清液，加入凍存液，輕輕吹吸均勻，每管等量1ml裝入凍存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃過(guò)夜，最后放入液氮罐。

04細(xì)胞復(fù)蘇：

試劑：含血清的培養(yǎng)基；

流程：從液氮中取出凍存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴鍋中，解凍時(shí)，邊晃動(dòng)邊觀察，當(dāng)看到只有一小塊冰存在時(shí)，即可從水浴鍋中取出，打開(kāi)凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻，1000r/min,離心五分鐘，吸掉上清液，沉淀中加入適量培養(yǎng)液，放入孵箱中，培養(yǎng)。還有就是：復(fù)蘇的細(xì)胞，需要在24小時(shí)后，換一次培養(yǎng)液。

最后：在這里特別感謝B站上無(wú)私分享的細(xì)胞培養(yǎng)的視頻資源，正是你們的分享，幫助了我，我也會(huì)繼續(xù)把我學(xué)到的繼續(xù)分享，幫助更多的人！如果大家想要獲得這份視頻資源的話，可以在后臺(tái)私聊小編獲取哦，里面關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的知識(shí)講解的超級(jí)詳細(xì)！明天我會(huì)繼續(xù)介紹細(xì)胞培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)以及WB的操作的步驟和原理。

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隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和普及，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科研究的重要工具。然而，要進(jìn)行一次成功的細(xì)胞培養(yǎng)并不是件輕松簡(jiǎn)單的事情。

要想在一次細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中獲得足量且優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)物，通常要做到以下幾點(diǎn)：活力好且無(wú)污染的種子細(xì)胞；適合該細(xì)胞生長(zhǎng)的*培養(yǎng)基；安全無(wú)污染的試劑耗材；嚴(yán)格的無(wú)菌操作；完備的細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)體系。在這幾點(diǎn)當(dāng)中，有些小的細(xì)節(jié)往往容易被忽視，快來(lái)看看你是否中過(guò)招吧！

1.及時(shí)保種—未雨綢繆，有備無(wú)患：就算是細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)再豐富，細(xì)胞房條件再好，也無(wú)法100%避免微生物污染。一旦培養(yǎng)物發(fā)生污染，將會(huì)很難補(bǔ)救。所以，在拿到種子細(xì)胞后，及時(shí)“備份"不失為一種明智之舉。具體做法是：如果拿到的是一瓶密度合適的活細(xì)胞（以T25培養(yǎng)瓶為例）--第一次傳代時(shí)，一半細(xì)胞直接凍存一支保種，剩下一半細(xì)胞接種至一個(gè)（或多個(gè)，比例視細(xì)胞增殖速度、細(xì)胞類型而定）新的培養(yǎng)瓶；如果拿到的是凍存管--先復(fù)蘇至一個(gè)培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)到傳代密度后，按上面活細(xì)胞處理方法保種。這樣一來(lái)，可以大大減少培養(yǎng)物還未大量擴(kuò)增就被污染或狀態(tài)差導(dǎo)致無(wú)種子可用的尷尬境地啦！

2.PBS的選用：傳代之前需要用PBS洗去殘留培養(yǎng)基是因?yàn)槠渲械腃a+、Mg+會(huì)降低胰蛋白mei活性。所以，一定要使用DPBS或者不含Ca+、Mg+的PBS哦！否則可能會(huì)出現(xiàn)消化時(shí)間變長(zhǎng)、消化不*甚至消化不下來(lái)細(xì)胞的情況。

3. 消化時(shí)間的把握：說(shuō)明書上的消化時(shí)間僅供參考，不要*遵循說(shuō)明書上的消化時(shí)間，因?yàn)橄瘯r(shí)間和細(xì)胞密度、胰mei效價(jià)甚至細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。要邊消化邊在顯微鏡下觀察（期間不要頻繁晃動(dòng)培養(yǎng)瓶），把握最佳的消化時(shí)間是細(xì)胞培養(yǎng)中的重中之重！

4、消化終止液的選用：一般使用2倍胰mei體積的*培養(yǎng)基或者等體積大豆胰蛋白mei抑制劑來(lái)終止mei消化作用，但在使用*培養(yǎng)基終止時(shí)要注意必須確認(rèn)該*培養(yǎng)基含有10%FBS。如果該細(xì)胞采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，要使用等體積大豆胰蛋白mei抑制劑來(lái)終止消化。

5.培養(yǎng)基的小細(xì)節(jié)：培養(yǎng)基能否用來(lái)培養(yǎng)你的細(xì)胞的關(guān)注點(diǎn)除了配方是否合適、是否在保質(zhì)期內(nèi)、有無(wú)微生物污染以外，還需關(guān)注培養(yǎng)基PH值--最直觀的方法是看培養(yǎng)基是否變成紫紅色。如果培養(yǎng)基是紫紅色，說(shuō)明此時(shí)PH偏高，呈堿性。很多細(xì)胞對(duì)PH值較為敏感（如BV-2，THP-1），偏堿可能導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差甚至凋亡。為了避免出現(xiàn)這種情況，可在接種細(xì)胞前將適量培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶，然后放入CO2培養(yǎng)箱靜置20Min以調(diào)整PH（非透氣瓶要擰松瓶口）。可以這么做的原因是因?yàn)榻^大多數(shù)培養(yǎng)基（L-15培養(yǎng)基除外）都具PH緩沖系統(tǒng)。

6.經(jīng)常鋪不勻細(xì)胞怎么辦：一般使用“十字法"搖勻細(xì)胞，但如果把握不好力度和搖晃次數(shù)的話很可能無(wú)法鋪勻細(xì)胞，為自己的實(shí)驗(yàn)或下次傳代帶來(lái)不必要的麻煩。解決辦法是：將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶后立起培養(yǎng)瓶輕輕吹打培養(yǎng)基2-3次后立即平放入培養(yǎng)箱，在細(xì)胞貼壁前不再搬動(dòng)培養(yǎng)瓶。