人結腸癌奧沙利鉑耐藥株HCT-8+Oxaliplatin培養(yǎng)說明

簡介：細胞形成緊密堆積的上皮細胞集落，細胞核大，細胞質少；在游離細胞表面觀察到許多相當均勻的微絨毛；細胞產生 CEA；通過細胞遺傳學研究，HCT-8 細胞系與 HRT-18 細胞系相同。

貨號：WS1048

規(guī)格：1×10? 細胞/T25 培養(yǎng)瓶

一、細胞基本信息

- 細胞來源：結腸

- 細胞形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

-傳代比例/細胞消化：1：2傳代，消化2-3分鐘

- 倍增時間：每周2-3次

- 細胞含量：＞1×10? 細胞/瓶

- 包裝規(guī)格：T25 培養(yǎng)瓶 / 1mL 凍存管

- 產品用途：僅供科研使用，不可作為動物或人類疾病的治療產品使用。

二、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1. 培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)基；10%胎牛血清；Oxaliplatin 1 μg/mL ；1%雙抗

推薦血清：WinSera FBS500 - WP - 002

2. 培養(yǎng)條件

- 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%

3. 凍存與儲存

- 凍存液：90%胎牛血清 + 10%DMSO（現(xiàn)配現(xiàn)用）

- 儲存條件：液氮長期保存

備注：收到細胞后按照下面的要求操作：培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)液是不含藥物的。待細胞長到40-50%的匯合度時，去掉培養(yǎng)液，加入含0.5 μg/mL Oxaliplatin藥物的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，這段時間肯定會有小部分細胞懸浮起來，但是不要緊，通過換液可以去掉，下面的細胞待長滿就可以消化傳瓶了，一兩代之后可以將藥物濃度提高到1μg/mL，含藥培養(yǎng)液用于細胞培養(yǎng)都沒問題的，凍存的時候就不要在凍存液里面加藥物了。（注明：用不含藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)一周到兩周，再用含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)。）如需進行實驗，請?zhí)崆爸辽?周更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

三、運輸形式與接收處理

1. 常溫發(fā)貨（T25 瓶活細胞）

收到細胞后，先對 T25 培養(yǎng)瓶瓶身進行表面消毒；將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱靜置 2 - 3 小時；觀察細胞密度與生長狀態(tài)，拍攝 2 - 3 張清晰照片反饋給銷售；細胞密度達標即可進行傳代，前期傳代比例建議為 1:2；待細胞再次長滿后，將其中一整瓶細胞凍存為 1 支 1mL 凍存管，另一瓶繼續(xù)傳代；建議反復凍存 2 - 3 支種子細胞后，再進行擴增實驗，避免因突發(fā)情況導致細胞斷種。

備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用于培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議 T25 培養(yǎng)瓶按 1:2 傳代。

2. 干冰發(fā)貨（凍存管細胞）

常規(guī)發(fā)貨為 2 支凍存管，建議復蘇 1 支、留存 1 支備用；若支復蘇失敗，嚴格按照廠家標準復蘇流程操作第二支；若兩支均復蘇失敗，請立即留存復蘇全過程照片，并時間通知銷售處理。

四、細胞培養(yǎng)步驟

1.凍存細胞復蘇

- 將 1mL 細胞懸液凍存管置于 37℃水浴，快速搖晃至解凍；

- 加入含 4 - 6mL 培養(yǎng)基的離心管中輕柔混勻；

- 1000RPM 離心 3 - 5 分鐘，棄去上清液；

- 用培養(yǎng)基重懸細胞，接種至含 6 - 8mL 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶/皿；

- 37℃培養(yǎng)過夜，次日在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)與密度。

2.對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：（細胞密度 80% - 90% 可傳代）

- 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1 - 2 次。

- 加入 0.25％（w/v）胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 于培養(yǎng)瓶中（T25 瓶 1 - 2mL，T75 瓶 2 - 3mL），置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 - 2 分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入 3 - 4ml 含 10%FBS 的培養(yǎng)基來終止消化。

- 輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 3 - 5min，棄去上清液，補加 1 - 2mL 培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按 1:2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6 - 8ml 按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據實際情況按 1:2 - 1:5 的比例進行。

3.對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

- 注：次傳代推薦傳代比例為 1:2，以后傳代比例可根據客戶需要自行決定。

- 方法一：收集細胞，1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補加 1 - 2mL 培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按 1:2 到 1:5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

- 方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

4.細胞凍存：收到細胞后建議在培養(yǎng)前 3 代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

五、生物安全注意事項

1. 所有動物細胞均視為具有潛在生物危害性，必須在二級生物安全柜內操作，做好個人防護；所有廢液及接觸過細胞的器皿，需經滅菌處理后方可丟棄。

2. 復蘇凍存細胞時，務必佩戴防護手套、防護服及防護面罩；凍存管浸沒在液氮中可能發(fā)生泄漏并灌入液氮，解凍時液氮氣化易導致容器爆裂、瓶蓋崩飛造成人員劃傷等傷害，操作時務必謹慎。

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