人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS-RA培養(yǎng)說明書

簡介：滑膜是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，淡紅色，平滑閃光，薄而柔潤，由疏松結(jié)締組織組成。關(guān)節(jié)腔內(nèi)的所有結(jié)構(gòu)，除關(guān)節(jié)軟骨、半月軟骨板以外,即便是通過關(guān)節(jié)腔的肌腱、韌帶等均全部為滑膜所包裹，滑膜分泌滑液，在關(guān)節(jié)活動中起重要作用。正常滑膜分為兩層，即薄的細(xì)胞層(內(nèi)腔層)和血管層(內(nèi)膜下層)，是血管豐富的關(guān)節(jié)囊內(nèi)膜，貼附于非關(guān)節(jié)面部分，覆蓋于關(guān)節(jié)囊內(nèi)的骨面上，不在軟骨面上，此部分稱為邊緣區(qū)或“裸區(qū)"?；こ史奂t色，光滑發(fā)亮、濕而潤滑，有時可見絨毛，內(nèi)含膠原性纖維，滑膜細(xì)胞有A、B兩型。巨噬細(xì)胞樣A型細(xì)胞，表面有絲狀偽足、漿膜內(nèi)陷、囊泡、線粒體、溶酶體、胞漿纖維和高爾基體，具有吞噬功能；B型成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS) ，有高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，是介導(dǎo) RA 關(guān)節(jié)破壞的主要細(xì)胞。

貨號：WS1086

規(guī)格：1×10? 細(xì)胞/T25 培養(yǎng)瓶

一、細(xì)胞基本信息

- 細(xì)胞來源：關(guān)節(jié)滑膜組織

- 細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長

- 傳代比例/細(xì)胞消化：1:2傳代貼壁部2-3分鐘

- 倍增時間：每周 2-3次

- 細(xì)胞含量：＞1×10? 細(xì)胞/瓶

- 包裝規(guī)格：T25 培養(yǎng)瓶 / 1mL 凍存管

- 產(chǎn)品用途：僅供科研使用，不可作為動物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。

二、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1. 培養(yǎng)基

DMEM/F12培養(yǎng)基；10%胎牛血清；1%雙抗

推薦血清：WinSera FBS500 - WP - 002

2. 培養(yǎng)條件

- 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%

3. 凍存與儲存

- 凍存液：90%胎牛血清 + 10%DMSO（現(xiàn)配現(xiàn)用）

- 儲存條件：液氮長期保存

三、運輸形式與接收處理

1. 常溫發(fā)貨（T25 瓶活細(xì)胞）

收到細(xì)胞后，先對 T25 培養(yǎng)瓶瓶身進(jìn)行表面消毒；將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱靜置 2 - 3 小時；觀察細(xì)胞密度與生長狀態(tài)，拍攝 2 - 3 張清晰照片反饋給銷售；細(xì)胞密度達(dá)標(biāo)即可進(jìn)行傳代，前期傳代比例建議為 1:2；待細(xì)胞再次長滿后，將其中一整瓶細(xì)胞凍存為 1 支 1mL 凍存管，另一瓶繼續(xù)傳代；建議反復(fù)凍存 2 - 3 支種子細(xì)胞后，再進(jìn)行擴(kuò)增實驗，避免因突發(fā)情況導(dǎo)致細(xì)胞斷種。

備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用于培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議 T25 培養(yǎng)瓶按 1:2 傳代。

2. 干冰發(fā)貨（凍存管細(xì)胞）

常規(guī)發(fā)貨為 2 支凍存管，建議復(fù)蘇 1 支、留存 1 支備用；若支復(fù)蘇失敗，嚴(yán)格按照廠家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)蘇流程操作第二支；若兩支均復(fù)蘇失敗，請立即留存復(fù)蘇全過程照片，并時間通知銷售處理。

四、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1.凍存細(xì)胞復(fù)蘇

- 將 1mL 細(xì)胞懸液凍存管置于 37℃水浴，快速搖晃至解凍；

- 加入含 4 - 6mL 培養(yǎng)基的離心管中輕柔混勻；

- 1000RPM 離心 3 - 5 分鐘，棄去上清液；

- 用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至含 6 - 8mL 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶/皿；

- 37℃培養(yǎng)過夜，次日在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)與密度。

2.對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：（細(xì)胞密度 80% - 90% 可傳代）

- 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1 - 2 次。

- 加入 0.25％（w/v）胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 于培養(yǎng)瓶中（T25 瓶 1 - 2mL，T75 瓶 2 - 3mL），置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 - 2 分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入 3 - 4ml 含 10%FBS 的培養(yǎng)基來終止消化。

- 輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 3 - 5min，棄去上清液，補加 1 - 2mL 培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按 1:2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6 - 8ml 按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按 1:2 - 1:5 的比例進(jìn)行。

3.對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

- 注：次傳代推薦傳代比例為 1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自行決定。

- 方法一：收集細(xì)胞，1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補加 1 - 2mL 培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按 1:2 到 1:5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

- 方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

4.細(xì)胞凍存：收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前 3 代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

五、生物安全注意事項

1. 所有動物細(xì)胞均視為具有潛在生物危害性，必須在二級生物安全柜內(nèi)操作，做好個人防護(hù)；所有廢液及接觸過細(xì)胞的器皿，需經(jīng)滅菌處理后方可丟棄。

2. 復(fù)蘇凍存細(xì)胞時，務(wù)必佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服及防護(hù)面罩；凍存管浸沒在液氮中可能發(fā)生泄漏并灌入液氮，解凍時液氮氣化易導(dǎo)致容器爆裂、瓶蓋崩飛造成人員劃傷等傷害，操作時務(wù)必謹(jǐn)慎。