原代細胞培養(yǎng)注意事項

錯誤1：

一小管原代細胞在水浴中解凍一段時間。

糾正1：

原代細胞對解凍過程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴中，保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的。然后應(yīng)立即從水浴中取出小瓶，并轉(zhuǎn)移到無菌操作臺。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準備就緒，以便可以立即用于接種細胞，并置于培養(yǎng)箱中。

錯誤2：

解凍match小瓶后直接離心原代細胞。

糾正2：

我們不建議在解凍后離心細胞，因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復(fù)原代細胞后的第二天更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的DMSO。

錯誤3：

允許原代細胞變得過于融合。

糾正3：

當(dāng)生長至100％匯合時，原代細胞可以變得衰老。記住，原代細胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細胞的生長。我們建議在細胞達到90-95％融合時，對原代細胞進行傳代培養(yǎng)。

錯誤4：

傳代原代細胞時過度胰蛋白酶消化。

糾正4：

當(dāng)細胞傳代時，使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監(jiān)測細胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。

錯誤5：

原代細胞可以很容易地重新凍存。

糾正5：

通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代細胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導(dǎo)致細胞死亡或損傷。

錯誤6：

原代細胞可以無限的增殖。

糾正6：

與細胞系不同，原代細胞具有有限的擴增能力。我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移。此外，如果你正在使用一個增值困難的細胞類型，你應(yīng)該密切監(jiān)測細胞形態(tài)，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細胞。

錯誤糾正后就該步入正軌啦——

應(yīng)如何進行凍存細胞的培養(yǎng)？

下列步驟以單管凍存細胞進行培養(yǎng)的實驗方案為例。

● 準備一燒杯37°C的水。

● 從液氮儲存中取出一管細胞，注意保護手和眼睛。

● 擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。

● 將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進行解凍，直至凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細胞迅速解凍。

● 用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級A型層流細胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥中。

● 打開管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。

                                                          臺盼藍染色

● 從管中吸取20 uL細胞懸液，并將其稀釋于20 uL臺盼藍溶液中。

● 使用血細胞計數(shù)板來確定每毫升懸液中的活細胞數(shù)。

● 將管中懸液（1 mL）稀釋至產(chǎn)品說明中的推薦濃度。

● 將5 mL細胞懸液加入25 cm2培養(yǎng)瓶，或?qū)?5 mL細胞懸浮液加入75cm2培養(yǎng)瓶中。

● 搖勻培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以分散細胞。許多類型的細胞都會迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細胞，細胞可能生長不均勻。

● 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。為了獲得最佳結(jié)果，培養(yǎng)開始后至少在24小時之內(nèi)不要擾動細胞。

是否可以對擴增后的細胞重新凍存？如果可以該如何操作？

當(dāng)從細胞庫購買的凍存或正處于增殖期的細胞，可對其進行擴增和重新凍存。不過，凍存操作可能會對細胞的生長狀態(tài)有所影響。下列實驗方案為大家提供了一份使用無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基凍存細胞的基礎(chǔ)指南。

請注意：由于凍存設(shè)備與個人技術(shù)之間的差異，我們無法確保使用本方案凍存的細胞在復(fù)蘇后能夠保持活力，我們也無法為研究用戶實驗室凍存細胞的效果進行擔(dān)保。

● 使用37°C水浴化凍無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基或4°C條件下過夜化凍。

● 如果在水浴中進行化凍，請確保溫度不要超過37°C，也勿將該產(chǎn)品延長時間置于37°C。

● 無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基在使用前應(yīng)置于4°C條件下平衡。為獲得優(yōu)結(jié)果，推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱，也可使用細胞凍存盒。

● 如需用酶試劑解離培養(yǎng)器皿表面的細胞，則需使用對應(yīng)的終止溶液重懸細胞以中和酶的效果。

● 通過離心沉淀細胞。

● 去除上清液后，使用預(yù)冷的無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基以5x10E5至3x10E6細胞/毫升的密度重懸細胞。

● 將細胞懸液分裝至合適數(shù)量的凍存管中。

● 將細胞盡快冷卻至4°C。

● 如果使用控制變溫速率的冰箱：以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品，直至–40°C。之后按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用細胞凍存盒：請按照說明書來準備凍存盒。

● 為獲得最佳結(jié)果，推薦大家在細胞溫度降至–80°C后，盡快將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮儲存設(shè)備的氣相中。

● 作為無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基的替代品，可使用該凍存細胞推薦的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO進行細胞凍存。 

組織塊貼壁法分離細胞時：注意組織塊貼壁2-3h后，補液時沿壁輕輕加入培養(yǎng)基，防止組織塊漂浮。

特別提醒：

如果用血清培養(yǎng)原代細胞，那么需要用到更高級別的胎牛血清，特級胎牛血清，

千舍推薦：WinSera FBS500-WP-002、PAN ST30-2602、BOVOGEN 新西蘭SFBS